Cy7 DiC18（DiIC 18（7）; DiR）是一种亲脂性长链羰花青染料, 产生近红外荧光，被广泛用作Di来标记细胞，细胞器，脂质体，病毒和脂蛋白。
Cy7 DiC18 (DiIC 18(7); DiR) is a lipophilic long-chain carbocyanine dye that produces near-infrared fluorescence and is widely used as Di to label cells, organelles, liposomes, viruses and lipoproteins. The two long 18-carbon chains of DiR insert into the cell membrane, resulting in specific and stable cell staining with little dye transfer between cells. DiR exhibits pronounced infrared fluorescence, which facilitates multicolor imaging and flow cytometry analysis of living cells. DiR is of great significance in in vivo imaging or tracking. The emitted infrared light can efficiently pass through cells and tissues, and the background fluorescence level in the infrared range is very low[1].
Cy7 DiC18（DiIC 18（7）; DiR）是一种亲脂性长链羰花青染料, 产生近红外荧光，被广泛用作Di来标记细胞，细胞器，脂质体，病毒和脂蛋白。DiR的两条长18碳链插入细胞膜，导致特异和稳定的细胞染色，细胞之间几乎没有染料转移。DiR表现出明显的红外荧光，有利于活细胞的多色成像和流式细胞术分析。DiR在体内活体成像或者示踪中意义非凡，所发射的红外光可以高效地穿过细胞和组织，并且在红外光范围内的本底荧光水平很低[1]
参考文献:
[1]. Shiyan Fu,Ruihao Yang,Junjie Ren,Jiahui Liu,LeiZhang,Zhigang Xu,Yuejun Kang,and Peng Xue.Catalytically Active CoFe204 Nanoflowers for Augmented Sonodynamic and Chemodynamic Combination Therapy with Elicitation of Robust Immune Response.ACS Nano Article ASARDOI: 10.1021/acsnano.1c03128.
本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1.细胞膜染色液制备
(1)配置DMSO或EtOH 储存液:储存液用DMSO或EtOH配置,浓度1~5mM。
注意:未使用的储存液分装保存在-20℃避光保存，避免反复冻融。
(2)工作液制备:用合适的缓冲液(如:无血清培养基，HBSS或PBS)稀释储存液，配制浓度为0.5~5μM的工作液。
注意:工作液的最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的十倍以上寻找最佳条件。
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2.悬浮细胞染色
(1)悬浮细胞经4°C、1000g离心3-5分钟，弃去上清液。用PBS清洗两次，每次5分钟。
(2)加入1mL的染料工作溶液，室温避光孵育5-30分钟。
注意：不同的细胞最佳培养时间不同，可以根据具体实验需求进行调整。
(3)孵育结束后，经1000-1500g离心5分钟，去除上清液，加入PBS清洗2-3次，每次5分钟。
(4)用预温的无血清细胞培养基或PBS重悬细胞。通过荧光显微镜或流式细胞术观察。
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3.贴壁细胞染色
(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。
(3)从盖玻片的一角加入100uL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
(4)室温避光孵育5-30分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。
(5)孵育结束后吸弃染料工作液，用预温的培养液洗盖玻片2~3次。
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4.外泌体染色
（1）取适当体积的Di染料储备液，添加到收集到的外泌体过滤上清液中，以达到5 μM的最终浓度，使用移液枪轻轻混匀；
（2）室温避光孵育30分钟，每5分钟轻轻翻转一次。
（3）将孵育完成的样品转移至离心管中，使用超速离心机中以100000g、 4°C的条件离心3小时；
（4）离心完成后在超净台中小心倾斜并弃去上清液，使用带无菌吸头的微量移液器，移去在试管内形成但未滴落的液体，即为标记好的外泌体；
注意：在该步骤中，游离染料随倾析的上清液一起消失，因此可以倾析溶液，但始终注意不要丢失沉淀。
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5.显微镜检测：Cy7 DiC18（DiR ）的激发/发射光分别为750/780nm。
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注意事项：
1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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