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CAS:N/A
分子式:N/A
分子量：N/A
溶解度:N/A
纯度：98%
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Background:
铁是生物体内含量最丰富的过渡金属元素之一，参与多种生理过程活动。近年来，研究者广泛关注活细胞内游离铁的存在，游离铁以稳定的氧化还原态形式存在，主要为亚铁离子（Fe2+）和铁离子（Fe3+）。在研究细胞内的还原环境、金属转运蛋白和Fe2+的水溶性等方面，了解Fe2+的机制比Fe3+更为重要。FerroOrange是一种新型荧光探针，可用于活细胞内Fe2+的荧光成像，但不适用于死细胞。FerroOrange与Fe2+反应后的荧光强度上升不可逆。可用荧光显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等进行检测。
上图为2 μl的1 mM FerroOrange和2 μl的10 mM的各种金属离子添加到1 ml的50 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中，并在室温下反应1小时后测得荧光强度。
Protocol(仅供参考):
1.1 从冰箱取出FerroOrange，置于室温解冻，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖。
1.2 往一管FerroOrange(24μg)内加入35μL DMSO，用枪反复吹吸混匀，使其完全溶解制备1mM FerroOrange储存液。若单次不能用完储存液，请分装并置于-20℃避光保存，一个月内使用。
1.3 于正式实验前，用中性缓冲液或无血清培养基来稀释1mM FerroOrange储存液到所需工作浓度(比如:1uM)，工作液需现配现用，尽快用完。【注意:酸性溶液会氧化FerroOrange，严重影响探针的效率】。
2. 荧光显微镜操作方法
2.1.细胞接种于荧光培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱中孵育过夜。
2.2.弃去上清液，并用HBSS或无血清培养基洗涤细胞3次。
2.3.更换含有药物的培养基，在37℃，5% CO2培养箱中孵育。
* 请根据药物特性优化孵育时间。
2.4.加入浓度为1 μM的FerroOrange工作液，在37℃，5% CO2培养箱中孵育30分钟。
* 加入FerroOrange染色剂后直接观察，不要洗涤。
2.5.在荧光显微镜下观察细胞。
3. 流式细胞仪操作方法
3.1将1 x 105个HeLa细胞（MEM培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）接种到6孔板中，并在37℃、5% CO2孵育箱中培养过夜。
3.2用无血清培养基（2 mL）三次洗涤细胞。
3.3向对照组细胞中加入无血清培养基（1 mL），硫酸铵亚铁处理组加入10mM的硫酸铵亚铁（10μL）（最终浓度：100μM）的无血清培养基。
3.4在37℃孵育箱中孵育细胞20分钟，并用HBSS（1 mL）三次洗涤细胞
3.5经胰蛋白酶消化（250 μL）后，用含血清的培养基（1 mL）停止反应，将1.25毫升的细胞悬液转移到微离心管中。
3.6 将细胞悬液以1,500转/分的速度离心3分钟。
3.7丢弃上清液，并向微离心管中加入HBSS（1 mL），通过振荡混合。
3.8将细胞悬液以1,500转/分的速度离心3分钟，并丢弃上清液。
3.9向细胞中加入1μM的FerroOrange和无血清培养基的MEM（300μL）。
3.10在37℃孵育箱中孵育细胞15-30分钟。
3.11染色细胞经过细胞过滤器过滤，并使用流式细胞仪分析样本。
4. 荧光检测
4.1对于荧光显微镜:通用的G激发滤片比如Cv3检测用的滤片。
4.2对于激光显微镜和流式细胞仪:532nm，514nm或561nm激光器用于激发。实在没有，亦可用488nm激光器。发射波长为580nm。
5. 荧光酶标仪操作方法
5.1 进行组别设置
样品A：无添加剂(仅HeLa细胞)。
样品B：添加了铁螯合试剂2,2`-bipyridyl(Bpy)的HeLa细胞。
样品C：添加铁(硫酸铵铁)的HeLa细胞。
5.2 在96孔黑板(透明底)上接种100 μl HeLa细胞悬液，使其达到10,000 cells/well，在37℃ 5% CO2 培养箱中过夜培养。
5.3 样品C的细胞用MEM(不含FBS)100 μl洗涤3次。
5.4 向样品C中添加100 μl硫酸铵铁(II)/MEM(不含FBS) (最终浓度: 100 μM)，在37℃ 5% CO2培养箱中静置30分钟。
5.5 用100 μl HBSS洗涤所有孔的细胞3次。
5.6 向样品A和C中添加100 μl的1 μM FerroOrange working solution ，向样品B中添加100 μl含有FerroOrange(最终浓度:1 μM)和Bpy(最终浓度:100 μM)的HBSS溶液，在37℃ 5%CO2培养箱中培养30分钟。
5.7 用多功能读板器检测各样品的荧光强度(Ex:543 nm,Em:580 nm)。
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