HPF
A cell permeable, fluorescent dye for detection of highly reactive oxygen species
此产品仅用于科学研究，我们不为任何个人用途提供产品和服务
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包装价格促销价数量
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500ug￥2800.002240.00- +
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1mg￥5300.004240.00- +
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5mg￥22288.0017830.00- +
- 货号: ajci71982
- CAS: 359010-69-8
- 别名: Hydroxyphenyl Fluorescein; 羟苯基荧光素;HPF
- 分子式: C26H16O6
- 分子量: 424.4
- 纯度: ＞98%
- 溶解度: 20mg/mL in ethanol, or in DMF , or in DMSO
- 储存: Store at -20°C, protect from light
- 库存: 现货
Background
The biology of highly reactive oxygen radical species is of great interest in many biomedical research disciplines, including neurodegeneration, aging, cancer, and infectious diseases.[1] There are a number of fluorescent reagents, such as 2,7-dichlorodihydrofluorescein (DCDHF), that can be used to detect free radicals, but they have significant limitations due to their facile oxidation by light and numerous non-radical oxidants such as hydrogen peroxide (H2O2). [2] HPF is a cell-permeable aromatic amino-fluorescein derivative that has little intrinsic fluorescence. [3] It undergoes oxidation only by highly reactive oxygen species (hROS) such as the hydroxyl radical, peroxynitrite, and hROS generated from a peroxidase/H2O2 system. It is inert to hypochlorite ion, nitric oxide, hydrogen peroxide (H2O2), superoxide, and other oxidants. Upon oxidation, HPF is converted to the highly fluorescent molecule fluorescein, with excitation/emission maxima of 490/515 nm, respectively, allowing the simple direct detection of highly reactive biological radicals.
Reference:
[1]. Matés, J.M., Pèrez-Gómez, C., and Nu?ez de Castro, I. Antioxidant enzymes and human diseases. Clinical Biochemistry 32(8), 595-603 (1999).
[2]. Hempel, S.L., Buettner, G.R., O'Malley, Y.Q., et al. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radical Biology & Medicine 27(1), 146-159 (1999).
[3]. Setsukinai, K.i., Urano, Y., Kakinuma, K., et al. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J. Biol. Chem. 278(5), 3170-3175 (2003).
高度反应性氧自由基的生物学在许多生物医学研究领域，包括神经退行性疾病、衰老、癌症和传染病方面具有极大的研究价值[1]。有许多荧光探针，如2,7-二氯二氢荧光素（DCDHF），可用于检测自由基，但由于它们容易被光和许多非自由基氧化剂如过氧化氢（H2O2）氧化而具有重要局限性。[2] HPF是一种细胞渗透的芳香族氨基-荧光素衍生物，几乎没有固有荧光[3]。只有高度反应性氧自由基（如羟基自由基、过硝酸根离子和过氧化酶/H2O2系统产生的高度反应性氧自由基）能够使其氧化。它对次氯酸离子、一氧化氮、过氧化氢（H2O2）、超氧和其他氧化剂具有惰性。氧化后，HPF被转化为高度荧光的分子荧光素，其激发/发射最大值分别为490/515 nm，从而可以直接检测高度反应性生物自由基。
Protocol
本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1.染色液的制备
(1)配置储存液:使用DMF溶解HPF，配置浓度为1-10mM的储存液。
注意:
①??? HPF能溶解于DMSO，但有数据显示DMSO是羟基自由基的淬灭剂，会干扰检测和降低灵敏性，建议用DMF作为溶剂；
②??? 与DMSO相比，DMF的细胞毒性相对较高，建议客户在达到理想荧光效果的前提下使用较低浓度的HPF，并且实验前验证细胞对相应剂量溶剂的敏感程度；
③??? 未使用的储存液分装后在-20℃或-80°C避光保存，避免反复冻融。
(2)配置工作液:用合适的缓冲液(如HHBS或PBS)稀释储存液，配制浓度为1-10μM的工作液。
注意:请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配。
2.细胞悬浮染色
(1)悬浮细胞：经4°C、1000g离心3-5分钟，弃去上清液，用PBS清洗两次，每次5分钟。
(2)贴壁细胞：使用PBS清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min。
(3)加入HPF工作溶液重悬细胞，室温避光孵育5-30分钟。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。
(4)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除上清液，加入PBS清洗2-3次，每次5分钟。
(5)用预温的无血清细胞培养基或PBS重悬细胞，通过荧光显微镜或流式细胞术观察。
3.细胞贴壁染色
(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。
(3)从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
(4) 室温避光孵育5-30分钟。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。
(5)孵育结束后吸弃染料工作液，使用预温的培养液清洗盖玻片2~3次。
4.显微镜检测：HPF的最大吸收光/发射光波长为490/515nm。
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注意事项：
①? BSA和酚红会对HPF的荧光产生影响，建议使用不含BSA和酚红的缓冲体系或培养基进行实验；
②? HPF能用于溶液体系或胞内ROS检测，建议起始工作浓度1-10μM，请根据个人实验体系或参考文献进行优化；
③? 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭；
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
