MG-132实验原理及步骤

MG-132基本信息

MG-132是一种有效，可逆并且能渗透细胞20S蛋白酶体的抑制剂，IC50为100 nM，其抑制蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样肽酶活性。

货号：ajci5008

又名：Z-Leu-Leu-Leu-al；MG132；

溶解：90 mg/mL (189.22 mM)；Water Insoluble；Ethanol ：47.5 mg/mL (100 mM)

CAS：133407-82-6

分子式：C26H41N3O5
分子量：475.6
存储：Store at -20°C

MG-132生物活性:

1.体外研究:

MG-132抑制20s 蛋白酶体ZLLL-MCA的降解活性，IC50为100 nm，比ZLLAl（IC50为110 μM）的降解效率高1000倍以上。MG-132也能抑制钙蛋白酶，IC50 为1.2 μM。MG-132在20 nm的最佳浓度下诱导PC12细胞的轴突增殖，比ZLLAl 500高500倍。[1]  MG-132 （10 μM） I通过抑制蛋白酶体κBα介导，可有效抑制A549细胞中TNF-α诱导的NF-κB激活、白细胞介素-8 （IL-8）基因转录和IL-8蛋白释放。[2]  MG-132处理通过抑制26S蛋白酶体有效诱导p53依赖的kim-2细胞凋亡。[3] 与BZLLLcocho或PS-341不同，MG-132处理对26S蛋白酶体的糜蛋白酶白样（CT-L）和肽-谷氨酰肽水解（PGPH）活性的抑制较弱，而MG-132与BZLLcocho对比，能更有效地诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡（U266 和opm-2实验）。[4]  MG-132 （1 μM）通过激活AP-1家族成员c-fos和 c-Jun让traiL耐药的前列腺癌细胞敏感，从而抑制抗凋亡分子c-FLIP（L）。[5]  MG-132能显著增强六磷酸肌醇（IP6）的作用，以降低PC3 和DU145雄激素非依赖性前列腺癌（AIPCa）细胞系的细胞代谢活性。[6]

2.体内研究:

MG-132给药可有效恢复mdx小鼠骨骼肌纤维中的肌萎缩蛋白、β-营养不良聚糖蛋白、α-营养不良聚糖蛋白以及α-肌多糖蛋白的表达水平和质膜定位，减少肌膜损伤并改善肌萎缩的组织病理学信号。[7] MG-132治疗通过下调肌肉特异性泛素连接酶Atrogin-1MAFbx和murf-1mRNA，显著减少小鼠因固定而引起的骨骼肌萎缩。[8] 

MG-132实验步骤（仅供参考）：

1.激酶实验：

20S蛋白酶体抑制试验的反应混合物含有0.1 M三羟甲基氨基甲烷醋酸盐（缓冲液）、pH为7.0、20S蛋白酶体、MG-132和25μM底物，溶解于二甲基亚砜中，使最终体积为1 ml。在37°C下培养15分钟后，添加0.1 ml pH 9.0的10%十二烷基硫酸钠和0.9 ml 0.1 M缓冲液以停止反应。测定了反应产物的荧光。为了测定20S蛋白酶体的IC50，应含有不同浓度MG-132。[1]

2.细胞实验：

细胞系: KIM-2，HC11，和 ES

溶液配制: 溶解于二甲基亚砜，终浓度：25um 

实验时间: 24小时 ， 48小时

方法:用不同浓度的MG-132处理细胞于24小时和48小时后。通过离心收集上清液和单层细胞，固定在含70%乙醇的PBS中，并用吖啶橙染色。将等体积细胞和吖啶橙（5mgml PBS溶液）固定在显微镜玻片上，并通过荧光显微镜进行检测。对于膜联蛋白V分析——通过离心收集细胞并用膜联蛋白V和碘化丙啶染色；对于细胞分析——细胞在室温下在PBS中再水化10分钟，然后用碘化丙啶（5 mgml）染色。所有样本均采用Coulter epics XL流式细胞仪进行分析。[3]

3.动物实验：

动物模型: 雄性 mdx (C57BL/10ScSn DMD mdx) 小鼠

配方: 用二甲基亚砜溶解，PBS中稀释到所需浓度

药量: 10微克/公斤/天

给药方式: 注射[7]

我司质检谱图如下：

MG-132核磁氢谱：采用氘代氯仿作溶剂，分子41个氢全出，从检测谱图分析，各氢归属及数量正确，纯度应＞98%。

同时我们还做了质谱检测：根据M+1规则，MG-132质谱应出476，检测结果与理论完全符合

参考文献:

[1].Ling YH, Liebes L, Zou Y and Perez-Soler R. Reactive oxygen species generation and mitochondrial dysfunction in the apoptotic response to Bortezomib, a novel proteasome inhibitor, in human H460 non-small cell lung cancer cells, 2003; 278: 33714–33723.
[2].Qiu JH, Asai A, Chi S, et al. Proteasome inhibitors induce cytochrome c-caspase-3-like protease-mediated apoptosis in cultured cortical neurons. J Neurosci 2000; 20: 259–265.
[3].YH. Han, WH. Park, MG132 as a proteasome inhibitor induces cell growth inhibition and cell death in A549 lung cancer cells via influencing reactive oxygen species and GSH level, Human and Experimental Toxicology, 29(7) 607–614.
[4].Wu WK, Wu YC, Yu L, et al. Induction of autophagy by proteasome inhibitor is associated with proliferative arrest in colon cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 2008; 374: 258–263.
[5].Yan XB, Yang DS, Gao X, et al. Caspase-8 dependent osteosarcoma cell apoptosis induced by proteasome inhibitor MG132. Cell Biol Int 2007; 31: 1136–1143.
[6].ZhangW, Tong Q, Li S, Wang X andWang Q.MG-132 inhibits telomerase activity, induces apoptosis and G(1) arrest associated with upregulated p27kip1 expression and downregulated survivin expression in gastric carcinoma cells. Cancer Invest 2008; 26:1032–1036.
[7].Wu HM, Chi KH, Lin WW. Proteasome inhibitors stimulate activator protein-1 pathway via reactive oxygen species production. FEBS Lett 2002; 526: 101–105.