Rapamycin 雷帕霉素自噬实验

Rapamycin基本信息

Rapamycin（雷帕霉素）是一种从吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）获得的大环内酯类化合物，是一种有效的特异性mTOR抑制剂（HEK293细胞中IC50为0.1 nM），也是一种自噬激活剂和免疫抑制剂。

货号：ajci14304

别名：Sirolimus,(-)-Rapamycin, AY-22989, WY-090217, Antibiotic，AY22989

溶解度：≥ 45.709mg/mL in DMSO, ≥ 58.9 mg/mL in EtOH with ultrasonic

CAS：53123-88-9
分子式：C51H79NO13
分子量：914.18
纯度：＞98%
存储：Store at -20°C

Rapamycin体外活性

在刺激mTOR激酶活性的条件下，用Rapamycin（雷帕霉素）（0.05-50nM），iRap（0.5-500nM）或AP21967（0.5-500nM）处理HEK293细胞。发现所有三种化合物均抑制内源性mTOR，IC50值分别为0.1 nM，5 nM，10 nM[1]。雷帕霉素抑制CT-26腺癌细胞中VEGF的分泌。雷帕霉素（0.1μg/ml）处理的B16肿瘤细胞中VEGF mRNA的量略低于对照（4倍）。在雷帕霉素存在下，在测试的最高浓度（1μg/ml）下，CT-26和B16肿瘤细胞增殖适度下降。HUVEC对雷帕霉素非常敏感，在0.01μg/ml时具有显着效果。在低至0.01μg/ml的雷帕霉素浓度时，VEGF-induced HUVEC tubular formation被完全消除[2]。雷帕霉素通过抑制mTOR的功能，诱导雷帕霉素敏感的恶性胶质瘤U87-MG和T98G细胞自噬（非凋亡）。相反，在耐雷帕霉素的U373-MG细胞中，尽管mTOR下游分子p70S6激酶的磷酸化被显着抑制，雷帕霉素的抑制作用却很小，[3]。

Rapamycin体内活性

雷帕霉素在体内并未改变Akt本身或其mTOR非依赖性靶点GSK-3β的磷酸化及活性，而是专门阻断了mTOR12-17下游的靶点。在第7天和第14天，雷帕霉素在体内几乎完全阻止了跖肌重量和纤维大小的肥大性增加[4]。与媒介物处理的LS/+细胞相比，从雷帕霉素（2 mg/kg体重，腹膜内）处理的LS/+小鼠中分离出的心肌细胞的细胞大小显着减少[5]。接受相对低剂量RAPA（1.5mg/kg/d）的小鼠，在前20天显示肿瘤大小略微延迟增加。最低剂量的RAPA（0.15mg/kg/d）略微延迟肿瘤生长，但小鼠在第23天死亡。高剂量的RAPA（15 mg/kg/d）在前3周内引起肿瘤发展，有更明显的延迟，但此后肿瘤再次迅速生长，小鼠不久后死亡[2]。

Rapamycin激酶实验

Immunoblotting for the mTOR kinase assay:将HEK293细胞以2-2.5*10⁵个细胞/孔铺板于12孔板，在DMEM中，血清饥饿24小时。在37℃下用递增浓度的雷帕霉素（0.05-50nM）处理细胞15分钟。在37℃下加入血清至终浓度20%，持续30分钟。裂解细胞，分离细胞裂解物。通过SDS-PAGE，将解析的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用抗p70 S6激酶Thr-389的磷酸特异性一抗进行免疫印迹。数据分析使用ImageQuant和KaleidaGr。[1]

Rapamycin细胞实验

细胞系：U87-MG、T98G和U373-MG。用各种浓度的雷帕霉素处理细胞于72小时。为了评估细胞活力，通过胰蛋白酶消化收集细胞，用台盼蓝（trypan blue）染色，统计每个孔中的活细胞。为了确定细胞周期，将细胞用胰蛋白酶消化，用70%乙醇固定，流式细胞仪组用碘化丙啶染色。使用FACScan流式细胞仪和CellQuest软件分析样品的DNA含量。对于细胞凋亡检测，使用ApopTag细胞凋亡检测试剂盒，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术对细胞进行染色。为了检测酸性囊泡细胞器（AVO）的进展，将细胞用吖啶橙（1ug/mL）染色15分钟，并在荧光显微镜下检查。为了量化AVO的进展，将细胞用吖啶橙（1ug/mL）染色15分钟，用胰蛋白酶-EDTA从平板上取出，并使用FACScan流式细胞仪和CellQuest软件进行分析。为了分析自噬过程，将细胞与0.05mM丹(磺)酰戊二胺(MDC)在37℃温育10分钟；然后在荧光显微镜下观察。（仅供参考）[2]

Rapamycin质检

1. HNMR检测：考虑到溶解性，我们采用氘代DMSO作溶剂，400MHz核磁共振波谱仪检测样品氢谱，从化合物结构分析79个氢均出，从HNMR谱图可看出各氢个数、化学位移及归属与理论完全相符，且无杂质峰，纯度＞98%

   
   

2. MS质谱检测：做质谱时，该化合物离子化，MS应出914+23（钠离子）-1=936，检测结果与理论完全相符。

   
   

参考文献

1. Edwards SR, et al. The rapamycin-binding domain of the protein kinase mammalian target of rapamycin is a destabilizing domain. J Biol Chem. 2007 May 4;282(18):13395-401.

2. Guba M, et al. Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor. Nat Med. 2002 Feb;8(2):128-35.

3. Takeuchi H, et al. Synergistic augmentation of rapamycin-induced autophagy in malignant glioma cells by phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B inhibitors. Cancer Res. 2005 Apr 15;65(8):3336-46.

4. Bodine SC, et al. Akt/mTOR pathway is a crucial regulator of skeletal muscle hypertrophy and can prevent muscle atrophy in vivo. Nat Cell Biol. 2001 Nov;3(11):1014-9.

5. Marin TM, et al. Rapamycin reverses hypertrophic cardiomyopathy in a mouse model of LEOPARD syndrome-associated PTPN11 mutation. J Clin Invest. 2011 Mar;121(3):1026-43.