Disuccinimidyl Suberate|68528-80-3|安捷凯

Background

Disuccinimidyl Suberate is a water-insoluble, homobifunctional N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester), Disuccinimidyl Suberate does not possess a charged group and is lipophilic and membrane-permeable, which makes it useful for intracellular and intramembrane conjugations.

NHS esters react efficiently with primary amino groups (-NH2) in pH 7 to 9 buffers to form stable amide bonds. The reaction results in the release of N-hydroxysuccinimide. Proteins, including antibodies, generally have several primary amines in the side chain of lysine (K) residues and the N-terminus of each polypeptide that are available as targets for NHS-ester reagents. Disuccinimidyl Suberate is hydrophobic and dissolved in an organic solvent such as DMSO or DMF then added to the aqueous reaction mixture.

Application:

1. Chemical cross-linking of intracellular proteins prior to cell lysis and immunoprecipitation.

2. “Fix” protein interactions to identify weak or transient protein interactions.

3. Protein cross-linking generates bioconjugates through a single-step reaction.

4. Immobilize proteins to amine-coated surfaces.

References:
[1].Cox G W, Mathieson B J, Giardina S L, et al. Characterization of IL-2 receptor expression and function on murine macrophages[J]. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950), 1990, 145(6): 1719-1726.
[2].Knoller S, Shpungin S, Pick E. The membrane-associated component of the amphiphile-activated, cytosol-dependent superoxide-forming NADPH oxidase of macrophages is identical to cytochrome b559[J]. Journal of Biological Chemistry, 1991, 266(5): 2795-2804.
[3].Partis M D, Griffiths D G, Roberts G C, et al. Cross-linking of protein by ω-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters[J]. Journal of Protein Chemistry, 1983, 2: 263-277.

Protocol

以下步骤方法是该产品的示例应用，具体应用可适当优化。
一，蛋白质交联方案
A,实验材料：
1.无水DMSO或DMF，用于溶解Disuccinimidyl Suberate；
2.反应缓冲液：使用pH为7 ~ 9的非胺类缓冲液，如100mM磷酸钠，0.15M NaCl；20mM HEPES；100mM碳酸盐/碳酸氢盐；或50mM硼酸盐。
3.淬火缓冲液：1M Tris•HCl， pH7.5 (可加入1M甘氨酸或赖氨酸)通过透析或凝胶去除未反应的实际
B,操作步骤：
1. 在反应缓冲液中制备蛋白质溶液。
2. 使用前准备交联剂。将Disuccinimidyl Suberate溶于DMSO或DMF中。称量2mg Disuccinimidyl Suberate交联剂于微量离心管中，加入216μL溶剂，使成终浓度为25mM。
3.在蛋白质样品中加入交联剂。如果蛋白质浓度大于5mg/mL，使用10倍摩尔过量的交联剂。对于样品浓度小于 5mg/mL，使用20- 50倍摩尔过量的交联剂。建议使用终浓度为0.25-5mM的交联剂。
4. 将反应混合物在室温下孵育30分钟或在冰上孵育2小时。
5. 加入淬灭缓冲液淬灭反应，终浓度为20~50mM Tris，或通过透析/脱盐除去未反应的试剂。
6. 将淬火反应在室温下孵育15分钟。

二，细胞内和细胞外交联反应
交联反应可以在悬浮细胞或培养板上的贴壁细胞上进行。在培养板上时，交联反应主要发生在暴露的细胞表面。因此，交联前，必须充分冲洗细胞表面以去除培养基，否则含胺成分会使反应猝灭。使用浓度高的细胞悬浮液交联效率较高，因为反应中只需添加较少的交联试剂。一般情况下，1-5mM的终浓度的交联试剂是有效的。随着pH值的增加，NHS反应速度加快。因此，下面的例子中pH 为8.0，以便快速完成反应。
A,所需材料：
1.交联剂溶液：在使用前，将Disuccinimidyl Suberate溶解在干燥的DMSO中，使成10-25mM。
2.磷酸盐缓冲盐水(PBS)： 20mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH值为8。或使用pH7～9的HEPES，碳酸氢盐/碳酸盐/硼酸盐缓冲液替代。
3. 猝灭溶液:1M Tris, pH 7.5 (Tris或甘氨酸将猝灭反应。)
操作步骤：
1.将细胞悬浮在PBS (pH 8.0)中，约为25×10-6细胞/mL。
2.用冰冷的PBS (pH 8.0)洗涤细胞三次，去除含胺的培养基和蛋白质。对于细胞表面相互作用的研究，在细胞中加入配体，在4℃下孵育1小时。
3.加入Disuccinimidyl Suberate溶液至终浓度为1-5mM。
4.将反应混合物在室温下孵育30分钟。
5.加入猝灭溶液至终浓度为10-20mM Tris，淬灭反应。
6.淬灭反应在室温下进行15分钟。

注意：
1. Disuccinimidyl Suberate对湿度敏感。为了避免湿气凝结到产品上，在打开前必须将小瓶平衡到室温。
2. NHS -酯部分易水解，因此不要制备储存液，实验前现配现用。
3. 交联具有生物活性的蛋白质(如酶、抗体等)在偶联时可能导致活性损失，这可能是由分子构象变化引起的。当交联剂修饰结合底物或抗原中涉及的赖氨酸基团时，也可能发生活性损失。调整试剂与目标物的摩尔比可以改善活性损失。或者使用靶向不同官能团的交联剂。
4. NHS酯的水解是一个竞争性反应，随着ph值的增加而加快。在稀释的蛋白质或肽溶液中更容易发生水解。在浓蛋白溶液中，酰化反应更容易发生。

References:
[1].Partis M D, Griffiths D G, Roberts G C, et al. Cross-linking of protein by ω-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters[J]. Journal of Protein Chemistry, 1983, 2: 263-277.

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